HPLC：高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography \ HPLC)又称"高压液相色谱"、"高速液相色谱"、"高分离度液相色谱"、"近代柱色谱"等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。
问：什么是HPLC的“无限直径效应"？
答：
在HPLC分析中由于使用了高效微粒固定相及高压流动相，样品以柱塞式注入色谱柱后，因柱的阻力大，样品分子在柱中的分子扩散很小，直至它从色谱柱流出也未与色谱柱内壁接触，因而引起的色谱峰形扩展很小，能保持高柱效。
问：用HPLC 进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决？
答:
关于漂移问题：
1． 温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定
2． 流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等
3． 柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡
关于快速变化问题：
1． 流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定
2． 泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。
3． 流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合
问：液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？
答:
1． 筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。
2． 存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子。
问：HPLC 灵敏度不够的主要原因及解决办法？
答:
1． 样品量不足，解决办法为增加样品量
2． 样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子
3． 样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器
4． 检测器衰减太多。调整衰减即可。
5． 检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数
6． 检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。
7． 检测池中有气泡。解决办法为排气。
8． 记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。
9． 流动相流量不合适。调整流速即可。
10． 检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
问：做HPLC 分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？
答：
原因可能有：
1． 泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；
2． 比例阀失效，更换比例阀即可；
3． 泵密封垫损坏，更换密封垫即可；
4． 溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；
5． 系统检漏，找出漏点，密封即可；
6． 梯度洗脱，这时压力波动是正常的。
问：为什么HPLC 柱验收测试时柱压过高？
答：
柱压过高是HPLC 柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。
1． 拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；
2． 把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；
3． 将柱子的进出口反过来接在仪器上，用 10 倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；
4． 更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。 一般情况下， 在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题。
问：色谱柱中的流动相会排干吗？
答：
不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了？色谱柱还能使用吗？事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输送液体，而不能输送空气。
相比之下，另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同样，整个色谱柱干涸的情况不太容易发生，多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了，也不一定就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂（如经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润填料表面；已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要（以1mL/min的流速）冲一个小时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。
问：为什么会基线漂移？
答：
原因
1. 柱温波动。（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。）
2. 流动相不均匀。（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。）
3. 流通池被污染或有气体
4. 检测器出口阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）
5. 流动相配比不当或流速变化
6. 柱平衡慢，特别是流动相发生变化时
7. 流动相污染、变质或由低品质溶剂配成
8. 样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。
9. 使用循环溶剂，不提倡。未调整检测器。
10. 检测器没有设定在最大吸收波长处。
解决方法
1. 控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器
2. 使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用在线脱气或氦气脱气。
3. 用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用盐酸）
4. 取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。
5. 更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。
6. 用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。使用离子对试剂、缓冲盐更应注意平衡柱。
7. 检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂
8. 改变分析条件。使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。
9. 重新设定基线。使用新的流动相。
10. 将波长调整至最大吸收波长处。重选检测波长。
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