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细胞的冻存与复苏实验步骤和注意事项

  • 时间:2022-06-27
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核心提示:一、程序冻存步骤(需梯度降温)1、配置冻存液,冻存液推荐配比:55%(基础培养基)+40%(血清)+5%(DMSO)或90%胎牛血清+10%DMSO

       一、 程序冻存步骤(需梯度降温)
       1、 配置冻存液,冻存液推荐配比:55%(基础培养基)+40%(血清)+5%(DMSO)或90%胎牛血清+10%DMSO;推荐使用Procell通用血清型程序冻存液,货号PB180436;
       2、 制备好的细胞悬液计数,计算总细胞量;
       3、 细胞离心后尽量吸干净上清,离心转速1200rpm(250g)3min;
       4、 加入配置好的冻存液重悬,调整细胞浓度为3×106~1×107cells/mL;
       5、 分装入冻存管,一个冻存管分装1~1.5毫升;
       6、 推荐使用程序降温盒,分装好的冻存管转入程序降温盒后直接放入-80℃冰箱过夜;
       7、 如没有程序降温盒,则按下列顺序依次降温:室温→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃过夜→液氮保存,注意转移过程中要保冷,避免产生温差或冻存管融化;
       8、 从-80℃冰箱取出冻存管迅速转移到液氮长期保存。
       注意事项:
       1、 DMSO配制的时候会放热,一定要等冻存液冷却后使用,避免灼伤细胞;
       2、 细胞离心后尽量吸干净上清液,减少培养基残留,避免稀释冻存液;
       3、 不建议手动梯度降温,温度不稳定,容易降低存活率;
       4、 注意程序降温盒内异丙醇的量必须高于最低刻度线;冻存5次后异丙醇需要更换一次,以免影响冻存效果;程序降温盒需恢复到室温以后才能继续使用,不能从冰箱拿出来直接使用;
       5、 细胞悬液加入冻存液以后尽量短时间的在常温放置,DMSO常温下对细胞损伤大,分装完成后立即转入程序降温盒放到-80度冰箱,不需要放4度;
       6、 -80度冻存过夜后可以转入液氮长期保存,转入液氮的过程需要对冻存盒进行保冷,不要长时间在常温暴露,避免冻存管融化;
       7、 若没有液氮罐,存放在-80度的时候一定要放靠里面的位置,避免开关冰箱导致温度不稳定。
       8、 细胞冻存后应取出一管复苏,检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮内长期保存,为稳妥起见可在细胞冻存半年后复苏培养,观察细胞生长情况,再继续冻存;

       二、 非程序冻存步骤(需使用无血清冻存液)
       1、 冻存液丛冰箱提前拿出回温到室温,推荐Procell无血清非程序冻存液,货号PB180438;
       2、 制备好的细胞悬液计数,计算总细胞量;
       3、 细胞离心后尽量吸干净上清,离心转速1200rpm(250g)3min;
       4、 加入无血清非程序冻存液(PB180438)重悬,调整细胞浓度为3×106~1×107cells/mL;
       5、 分装入冻存管,一个冻存管分装1~1.5毫升;
       6、 分装好的冻存管直接转入-80度冰箱过夜,不需要程序降温盒;
       7、 转入液氮途中需将冻存管做好保冷措施,避免直接暴露于常温,快速转入液氮罐进行长期保存;
       注意事项:
       1、 由于没有使用冻存盒,在转入液氮的过程中一定要对冻存管做好保冷措施,不能直接用手拿,可以用干冰或者少量液氮保护后转移,操作过程注意安全;
       2、 转移过程要快,避免冻存管暴露于常温后融化;
       3、 若没有液氮罐,存放在-80度冰箱的时候一定要放靠里面的位置,避免开关冰箱导致温度不稳定;

       三、 细胞复苏步骤
       1、 将水浴锅预热至37℃,准备好干净的一次性PE手套,一个无菌离心管内加入9ml无菌培养基;
       2、 将细胞从液氮罐中取出放入PE手套中,迅速没入水浴锅,摇晃冻存管加速溶解,以1分钟内全部溶解为宜;
       3、 在超净台中将复苏好的细胞液加入到装有新鲜培养基的离心管内,1200rpm/min 离心3分钟,离心完毕去掉上清;
       4、 用适量与细胞对映的完全培养基重悬细胞,接入到无菌容器中(培养瓶或培养皿),补充培养基到适宜,放入培养箱培养;
       注意事项:
       1、 水浴锅的位置如果与液氮罐不是一个房间,需要对冻存管进行保冷后转移到水浴锅旁,避免路途细胞表面融化;
       2、 细胞溶解过程快速摇晃以加速溶解;
       3、 已溶解的冻存细胞尽量短时间的在常温存放,尽快离心去除DMSO;
       4、 贴壁细胞复苏24小时后观察,若密度达到80%,则正常传代;若密度不到80%则继续培养到48小时再换液;
       5、 悬浮细胞复苏3天内不建议离心换液;
       6、 对DMSO不敏感的细胞在复苏时也可不离心,减少操作步骤,也可降低污染的几率。将解冻的细胞悬液直接转移至T25细胞瓶内,补加新鲜培养基,放入温箱内培养。但培养12~24h后必须换新鲜的培养基,移除死细胞。
 

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